LAP .MIKROBIOLOGI

PEWARNAAN TUNGGAL

Tujuan Praktikum

1.      Mampu mempersiapkan sediaan/ preparat/ film bakteri secara benar.

2.      Mampu melakukan pewarnaan bakteri dengan satu macam zat warna.

3.      Mengamati dan menggambar bakteri yang telah diwarnai

Teori Dasar

Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya biasa, karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).

Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen, perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.

Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998).

Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa.

Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985)  :

1.      Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi.

2.      Memperjelas ukuran dan bentuk jasad

3.      Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.

4.      Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui.

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Irawan, 2008).

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut (Irawan, 2008):

a.       Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.

b.      Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif.

Alat dan Bahan

1.      Preparat bakteri Bacillus subtills dan sarcina

2.      Zat warna Fuchsin, methilen blue, gentian violet

3.      Kertas saring

4.      Akuades

5.      Alcohol 70%

6.      NaCl Fisiologis

Prosedur Kerja

                          

methilen blue  

         

NaCl Fisiologis

 Alcohol 70%          

 

Data Pengamatan

Klasifikasi Bakteri	Hasil Pengamatan
EScerchia colli
Sarcina Basil Kingdom : Bacteria Filum : Firmicutes Kelas : Bacilli Ordo : Lactobacilales Family : Sarcinacaceae Genus : Sarcina Spesies : Sarcina basil

Pembahasan

Pada praktikum ini kita membuat preparat bakteri, sebelum membuat preparat bakteri usahakan semua alat dan media yang digunakan tersebut harus steril. Sebelum memindahkan bakteri ke kaca objek kita harus memijarkan dulu jarum ose dan tabung reaksi bakteri, setelah itu ambil sedikit saja bakteri dari biakan induk bakteri lalu gesekan pada kaca objek secara hati- hati. Kalau bakteri terlalu tebal tetesi dengan air, dan sebarkan secara merata.

Setelah ose dipijarkan dan didinginkan, kemudian mengambil bakteri dari suatu sumber, ose tidak boleh kena api, karena dikhawatirkan bakteri akan mati. Mulut tabung reaksi tempat bakteri, harus dipanaskan dengan nyala api setelah penyumbat diambil dan setelah pengambilan bakteri selesai dan penyumbat ditutup kembali. Sebelum dan sesudah dipakai kawat ose harus dipijarkan, serta memanaskan mulut tabung reaksi sebelum dan sesudah dipakai karena hal tersebut merupakan teknik aseptik.

Ose dipijarkan dengan tegak agar seluruh batang ose dan bakteri yang menempel pada ose mati, setelah suspensi diteteskan di atas kaca alas, suspensi diratakan atau dilebarkan. Hal ini bertujuan agar bakteri tidak menumpuk (sehingga memudahkan dalam pengamatan). Preparat dicuci dengan air atau dihisap memakai kertas hisap.

Fiksasi bertujuan untuk mempercepat keringnya kaca alas atau preparat, jika pada kaca alas telah terdapat preparat yang akan diamati maka hal tersebut bertujuan agar mikroba mati dan preparat menempel pada kaca alas dan agar bakteri tidak mudah tercuci selama pewarnaan.

Beberapa faktor penyebab terjadinya kesalahan pada pewarnaan positif antara lain:

1.      Preparat yang kurang baik , disebabkan oleh penyebaran yang kurang atau tidak sempurna.

2.      Fiksasi yang kurang sempurna menyebabkan terbawanya sel bakteri pada saat pembilasan.

3.      Fiksasi yang terlalu lama menyebabkan terjadinya penyusutan sel.

4.      Pembilasan yang tidak benar contohnya pembilasan yang langsung mengenai sel karena dapat menyebabkan sel terbawa air.

Kesimpulan

·         Bakteri merupakan sel prokariotik berukuran lebih kecil dari sel eukariotik.

·         Bakteri diidentifikasi dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri yang berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.

·         Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup.

·         Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.

Daftar Pustaka

Dwidjoseputro.1964.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang : Djambatan

Iud. W, 2008, Teknik dan Metode Dasar Dalam Mikrobiologi, UMM Pres, Malang.

Pelczar, M. W., 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. UI Press. Jakarta.
Suriawiria, U., 1985. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.
Volk, W. A. dan Margareth F. W., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.

Listiawati, Mila. Modul Praktikum Mikrobiologi. UIN Sunan Gunung Djati. 2010 (http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis)